C에 대한 우선적인 토끼 항체 반응

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 9156(2023) 이 기사 인용

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펩타이드 면역 토끼에서 자란 항체는 수십 년 동안 생물학적 연구에 사용되어 왔습니다. 이 접근법이 광범위하게 구현되었지만 특정 단백질은 여러 가지 이유로 표적화하기 어려운 경우가 있습니다. 생쥐에서 주목된 한 가지 고려 사항은 체액성 반응이 손상되지 않은 단백질에 존재하지 않는 펩타이드 서열의 카르복실 말단을 우선적으로 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 펩타이드 면역원의 C-말단에 대한 우선적인 토끼 항체 반응의 빈도를 밝히기 위해 인간 NOTCH3에 대한 토끼 항체 생성 경험을 제시합니다. 인간 NOTCH3의 10개 펩타이드 서열에 대해 총 23개의 항체가 생성되었습니다. 이들 다클론 항체의 70% 이상(23개 중 16개)이 C-말단 선호로 결정되었습니다: NOTCH3 펩티드 반응성 항체는 주로 면역화 펩티드의 종결 유리 카르복실기를 표적으로 삼았습니다. C-말단 에피토프를 선호하는 항체는 면역원 구조의 유리 카르복실기를 제거한 C-말단이 확장된 재조합 표적 서열과 약하게 반응하거나 전혀 반응하지 않았습니다. 더욱이, 이들 항혈청 각각은 면역원의 C-말단 앞에서 잘린 단백질에 대한 항체 반응성을 나타내지 않았습니다. 이러한 항-펩티드 항체의 면역세포화학적 적용에서, 우리는 면역화 서열의 유리 C-말단을 발현하는 세포에 가장 잘 결합하는 재조합 표적에 대한 반응성을 유사하게 발견했습니다. 종합적으로, 우리의 경험은 토끼가 천연 단백질에 대한 사용을 제한할 것으로 예상되는 NOTCH3 유래 펩타이드의 C-말단 에피토프에 항체 반응을 탑재하는 강한 경향을 보여줍니다. 우리는 일반적으로 활용되는 실험 패러다임에서 항체 생성 효율을 향상시킬 수 있는 이러한 편견을 극복하기 위한 몇 가지 잠재적인 접근법에 대해 논의합니다.

연구용 항체의 개발과 적용은 단백질 연구에 필수적이었습니다. 연구용 항체 중에서 항펩타이드 항혈청은 많은 수의 단백질 코딩 유전자 서열의 해명과 펩타이드 합성의 기술 발전으로 인해 큰 호응을 얻었습니다. 이러한 발전으로 인해 단백질 표적을 생산하거나 정제할 필요 없이 동물을 면역화함으로써 일반적으로 어려움 없이 항혈청을 생산할 수 있습니다1,2.

대체로 성공적이었음에도 불구하고, 항펩타이드 면역화는 때때로 단백질 표적 검출에 유용한 항체를 생성하지 못합니다1,3. 실패는 펩타이드 항원이 표적 단백질과 동일한 형태를 채택하지 못하거나, 접근 불가능한 영역에 표적 서열이 묻혀 있거나, 펩타이드 면역원에 반영되지 않는 표적 단백질의 번역 후 변형에 기인합니다.

이전 연구에서 Liang과 동료6는 사용 가능한 항펩타이드 항체를 생성하지 못하는 또 다른 잠재적인 이유를 지적했습니다. 즉, 손상되지 않은 단백질에 존재하지 않는 면역화 펩타이드의 카르복실 말단(C 말단)에 대한 항체의 우선적 표적화입니다. 그들은 C-CAM1의 내부 에피토프로 마우스를 면역화하면 면역화 펩타이드의 C-말단에 주로 항체 반응이 나타난다고 보고했습니다. 쥐의 단클론 항체는 면역원의 C-말단에 의존하는 방식으로 면역화 펩타이드에 반응했지만, 이들 항체는 온전한 단백질에 결합하지 않았습니다. 연구자들은 마우스 유래 단일클론 항체가 손상되지 않은 단백질에 존재하는 펩티드 결합에 의해 제거되는 C 말단에 존재하는 카르복실산 부분을 필요로 한다고 결론지었습니다.

또 다른 연구에서 Edwards와 동료들은 개별 단백질의 C-말단에 해당하는 작은 펩타이드를 사용하여 토끼를 면역화하는 박테리아 단백질에 대한 항체를 생성하는 성공적인 접근 방식을 개발했습니다. 이 연구는 토끼가 펩타이드의 C-말단에 대해 효과적인 반응을 생성할 수 있으며 짧은 면역원에 대해 생성된 항혈청이 현저하게 특이적이라는 것을 나타냅니다. ELISA 검정의 펩티드 경쟁에 의해 평가된 바와 같이, 펩티드 면역원의 C-말단을 선호하는 항체의 상대적 비율은 보고된 여러 항체에 대해 높았습니다.